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免疫組化實驗檢測主要操作步驟：

1、洗載玻片：將載玻片置于重鉻酸鉀和濃H2SO4混合液中，目的是為了是載玻片上的硅膠等除去，同時使一些肉眼看不見的凹凸不平的表面變平整，便于組織吸附，然后置于清水中清洗，除去殘余的重鉻酸鉀和濃H2SO4(大約沖一個小時左右)，再將載玻片浸泡于酒精之中，然后放到架子上，置于37°C溫箱中，將多聚賴氨酸涂布于玻片的表面，由于Lys帶正電，而大多數的組織帶負電荷，從而產生吸附作用。
2、包埋組織：先在鐵模具中加入一些液態石蠟，先稍微冷卻，然后再將待包埋的組織置于石蠟之中，并排列整齊，再將塑料模具盒蓋上，最后加入少許液體石蠟，進行冷凍，使石蠟變成固態。
3、切片：將包埋好的組織從模具上取下來，并置于石蠟切片機上，切片機通過調節上下左右來來使組織和切割方向，然后調節切片的厚度，一般為5µm，如果比較難切，則可以適當調整厚度，用毛筆將切割的載玻片向外拉，并用小鑷子將包含有完整組織的載玻片置于40°C溫水中。
4、撈組織：當組織載玻片置于40°C溫水中之前，要先將水浴中的氣泡趕走，以免氣泡受熱上浮而貼到組織上，組織受熱展開，是組織不起皺紋，用載玻片撈組織時，一般取載玻片的下1/3或者下1/2一般每種組織撈5-6張，其中2-3張是備用的，每張載玻片上通常撈兩份組織，做對照使用，這樣形成的誤差就比較小了，而且撈載玻片的時候方向，以便觀察，再將撈出來的載玻片置于架子上，放入37°C溫箱中烘干。
5、脫蠟：依次將載玻片放入二甲苯-二甲苯-100%酒精-100%酒精-95%酒精-90%酒精-80%酒精-70%酒精，起脫蠟作用的主要是二甲苯，依據的是相似相溶的原理。一般在每個試劑中放10min，天氣熱可以少放幾分鐘，相反，天氣較冷的話，就要適當延長脫蠟時間，一般為12-15min。
6、抗原修復：脫蠟后在清水中沖洗一段時間，加入3%H2O2浸泡10min，從而除去內源性的過氧化氫酶，然后倒掉H2O2，在清水中洗兩次，再加入檸檬酸緩沖液，放入微波爐中蒸煮3min（中火），一般剛到沸騰即可，冷卻至室溫，然后再蒸煮一次，冷卻至室溫，蒸煮的目的是為了使抗原的位點暴露出來。
7、血清封閉：冷卻至室溫后，將檸檬酸緩沖液倒掉，水洗2次，并將載玻片置于PBS中5min，洗2次，擦干組織周圍的PBS液，馬上加上血清，使一些非特異性的位點封閉起來，然后放入37°C溫箱中半小時。血清稀釋10倍（900µlPBS：100µl血清封閉液）。
8、加一抗：將溫箱中的載玻片取出，用吸水紙擦干載玻片反面和正面組織周圍的血清，加一抗，如果做對照實驗，就在對照的組織上加PBS。加完一抗后于4°C冰箱中保存過一夜。
9、加二抗：將載玻片從冰箱中取出，放入PBS中洗3次，每次5min，擦干組織周圍的PBS后加上二抗，然后置于37°C溫箱中半小時。
10、加SABC：將片子從溫箱中取出，放入PBS中洗3次，每次5min，擦干組織周圍的PBS后加上SABC，然后置于37°C溫箱中半小時。SABC稀釋100倍（990µlPBS：10µlSABC）。
11、加顯色劑：將片子從溫箱中取出，放入PBS中洗3次，每次5min，擦干組織周圍的PBS后加上顯色劑。（顯色劑的配置：在1ml水中加1滴顯色劑A，搖勻，然后加1滴顯色劑B，搖勻，再加1滴顯色劑C，搖勻）   A：DAB、B：H2O2、    C：磷酸緩沖液。
12、復染：將顯色后的片子用清水沖洗一段時間后，浸泡于蘇木精中染色，一般動物組織為半分鐘，植物組織3-5min。
13、脫水：將復染后的片子置于水中沖洗后，依次將載玻片放入70%酒精-80%酒精-90%酒精-95%酒精-100%酒精-100%酒精-二甲苯-二甲苯。每個試劑中放置2min，最后浸泡在二甲苯中，搬到通風柜中。
14、封片：用(yong)(yong)中性樹膠(jiao)滴在組織旁(pang)邊(bian)，再用(yong)(yong)蓋(gai)玻片蓋(gai)上，要先放平一側(ce)，然后輕(qing)(qing)輕(qing)(qing)放下另一側(ce)，以免產生氣泡，封好片子后置于通風柜(ju)中晾干。

免疫組化實驗檢測注意事項：

切片(pian)(pian)組(zu)織得到很好處理(li)后在(zai)進(jin)行切片(pian)(pian)之前還應對玻璃片(pian)(pian)進(jin)行處理(li)，由于(yu)我們檢測抗(kang)(kang)原(yuan)是(shi)多種多樣的(de)(de)，因染色操作(zuo)(zuo)程(cheng)序復雜，時間較長，有些抗(kang)(kang)原(yuan)是(shi)要(yao)(yao)進(jin)行各種抗(kang)(kang)原(yuan)修復處理(li)，如微波(bo)、高壓、水溶酶等，玻片(pian)(pian)如果得不到很好的(de)(de)處理(li)，將(jiang)易造成脫片(pian)(pian)，為保證實驗的(de)(de)正常進(jin)行，要(yao)(yao)求(qiu)在(zai)貼片(pian)(pian)前對載玻片(pian)(pian)作(zuo)(zuo)適當處理(li)，必須在(zai)清洗干凈的(de)(de)玻片(pian)(pian)上進(jin)行粘合劑的(de)(de)處理(li)以防脫片(pian)(pian)。

1)Poly-L-Lysine 

一般采用分子(zi)量30000左右的(de)0.5%多(duo)聚賴(lai)氨酸，也可用試劑公司出售的(de)其濃溶液(ye)以1：10去離子(zi)水(shui)稀釋(shi)。方(fang)(fang)法是將玻片(pian)浸泡其中，傾(qing)盡余液(ye)，在60℃溫箱中烤干備用，此方(fang)(fang)法的(de)優點是可以用于多(duo)種組織(zhi)化(hua)學、及分子(zi)學檢測中的(de)應用，粘(zhan)貼效果，但價格稍貴。

2)明膠硫酸鉻鉀法

將(jiang)2.5g明膠加熱(re)溶(rong)于500ml蒸餾水中，溶(rong)解冷卻(que)后加入0.25g硫酸鉻鉀攪勻充分溶(rong)解即可使(shi)用。方法(fa)是將(jiang)玻片(pian)浸(jin)泡其中2 min，取出控盡液體入溫箱中烤干備用。此法(fa)價格便宜、方法(fa)簡單，任何實驗都可以(yi)使(shi)用，特別適用于大批量的使(shi)用，但(dan)應注意，如(ru)果液體變(bian)藍或粘稠狀停用。

3)APES (3-氨丙基-乙氧(yang)基甲(jia)硅(gui)烷)

此法(fa)必須現用(yong)現配。將洗(xi)凈(jing)玻片(pian)入1:50丙酮稀釋的APES中(zhong)，浸泡20s，取出稍停再入丙酮或蒸(zheng)餾(liu)水中(zhong)刷(shua)去末結合的APES晾干即可。用(yong)此方法(fa)粘合的玻片(pian)應(ying)垂直烤片(pian)不能平拷，否則組織片(pian)中(zhong)易出現氣(qi)泡。

切片(pian)必須保持切片(pian)刀銳利，切片(pian)要薄而(er)(er)平整(zheng)、無(wu)皺摺、無(wu)刀痕，如(ru)有上(shang)述問題的(de)切片(pian)在(zai)進行(xing)染色都將出現(xian)假陽性現(xian)象，切片(pian)厚度(du)一般為(wei)3~4μm，切好的(de)切片(pian)在(zai)60℃溫箱中(zhong)過一夜，注(zhu)意烤(kao)片(pian)的(de)溫度(du)不宜過高，否則易使組織細胞結構破壞，而(er)(er)產生抗原標記定(ding)位彌(mi)漫現(xian)象。

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