信帆生物-明膠酶譜法試劑盒檢測小技巧

    
基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)以無活性的酶原形式分泌，活化后能夠降解細胞外基質的膠原蛋白，又稱膠原酶。通過影響細胞外基質，膠原酶參與胚胎發育、形態發生、組織重塑等過程，并參與炎癥、腫瘤、心血管、神經等許多疾病過程。血漿與組織中的MMP-2、MMP-9參與各種生理與病理過程，其在診斷和治療中的意義日益受到重視。

檢測原理

本試(shi)劑(ji)盒采用酶(mei)譜(pu)(pu)法(fa)(Zymography)檢(jian)測(ce)MMP-2、MMP-9 活性(xing)。Zymography 是一種廣為使用的(de)、基于(yu)SDS-PAGE 電(dian)泳和反(fan)(fan)相(xiang)凝(ning)(ning)膠(jiao)(jiao)染色的(de)蛋(dan)(dan)白(bai)酶(mei)檢(jian)測(ce)方法(fa)，其靈敏(min)度(du)可達1 nM，高于(yu)ELISA方法(fa)，其基本原理和程序是：制(zhi)備加有膠(jiao)(jiao)原酶(mei)底(di)物的(de)SDS-PAGE 凝(ning)(ning)膠(jiao)(jiao)，含蛋(dan)(dan)白(bai)酶(mei)的(de)樣(yang)品(pin)在此凝(ning)(ning)膠(jiao)(jiao)中(zhong)進(jin)行(xing)電(dian)泳，電(dian)泳結束后取出凝(ning)(ning)膠(jiao)(jiao)與(yu)酶(mei)反(fan)(fan)應(ying)Buffer 孵育，凝(ning)(ning)膠(jiao)(jiao)染色與(yu)脫色。凝(ning)(ning)膠(jiao)(jiao)中(zhong)由于(yu)含底(di)物蛋(dan)(dan)白(bai)而被深染，形(xing)成(cheng)深色背景(jing)，但在有蛋(dan)(dan)白(bai)酶(mei)條帶的(de)位置，蛋(dan)(dan)白(bai)酶(mei)將(jiang)降解凝(ning)(ning)膠(jiao)(jiao)中(zhong)的(de)底(di)物蛋(dan)(dan)白(bai)，因(yin)而不被染色而形(xing)成(cheng)透亮區域，從而能(neng)同時指示MMP-2、MMP-9 的(de)大小(xiao)(xiao)(xiao)位置(酶(mei)譜(pu)(pu))及活性(xing)。本試(shi)劑(ji)盒提供MMP-2、MMP-9 特異(yi)蛋(dan)(dan)白(bai)底(di)物及酶(mei)學反(fan)(fan)應(ying)緩沖液(ye)，可檢(jian)測(ce)少至0.1~0.5μl 血液(ye)中(zhong)的(de)MMP-2、MMP-9 酶(mei)譜(pu)(pu)及活性(xing)，檢(jian)測(ce)靈敏(min)度(du)~1nM。試(shi)劑(ji)盒可進(jin)行(xing)50次標準小(xiao)(xiao)(xiao)膠(jiao)(jiao)檢(jian)測(ce)，如果(guo)小(xiao)(xiao)(xiao)膠(jiao)(jiao)加樣(yang)孔為10~15個(ge)，則(ze)總計(ji)可檢(jian)測(ce)500~750個(ge)樣(yang)品(pin)。
 

實驗中的小貼士告訴大家：

1.做酶譜要測定樣品蛋(dan)白的濃度(du)（同(tong)Western blot，建議用(yong)BCA法）；

2.酶譜法(fa)是測定樣品(pin)中(zhong)MMP-2、9活性(xing)的，如果(guo)煮(zhu)沸使蛋白變性(xing)就(jiu)沒(mei)有用了，故禁(jin)忌煮(zhu)沸；

3.上樣緩沖液中也不能加(jia)β-巰基乙醇，這點由western blot轉作(zuo)明(ming)膠(jiao)酶譜的朋友切記(ji)、切記(ji)；

4.蛋(dan)白上樣(yang)量(liang)必須保(bao)證一樣(yang)，不會出現一致(zhi)的透(tou)明條帶(dai)，如(ru)果不能保(bao)證上樣(yang)量(liang)一致(zhi)，測出的相對活性也沒有(you)統計分析的意義；

5.上樣(yang)時zui重要(yao)的一(yi)點，必須在4℃環境中(zhong)操作(zuo)，我(wo)用(yong)的是(shi)(shi)(shi)冰臺，同時所用(yong)的蛋白(bai)樣(yang)品（-80℃冰箱）不能是(shi)(shi)(shi)以前(qian)曾(ceng)解(jie)凍(dong)(dong)使用(yong)過的，必須是(shi)(shi)(shi)新(xin)取出的，因為只要(yao)解(jie)凍(dong)(dong)就會有(you)部分酶降(jiang)解(jie)，影(ying)響你(ni)的結果。此外做過一(yi)次酶譜的蛋白(bai)樣(yang)品也不要(yao)反復使用(yong)，下(xia)次應使用(yong)其它已分裝(zhuang)、未解(jie)凍(dong)(dong)過的樣(yang)品；

6.電泳(yong)后的(de)步(bu)驟很(hen)簡單(dan)，液體別配錯，照著(zhu)方法(fa)做就可以了。

如果(guo)你曾做(zuo)過Western blot，在這(zhe)里恭喜你了(le)，只要(yao)注(zhu)意(yi)幾個小細(xi)節，明膠酶(mei)譜對你非常簡單。

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