一、PCR技術服務概述及原理

　　PCR(Polymerase Chain Reaction)即聚合(he)酶(mei)鏈式反應，是在DNA聚合(he)酶(mei)的(de)(de)催化下，以(yi)特定(ding)的(de)(de)DNA為(wei)模板，以(yi)特定(ding)的(de)(de)核酸片段(duan)即PCR引物為(wei)擴增(zeng)起點和終點，通過變(bian)性、退火、延伸等步(bu)驟，在體(ti)外體(ti)系中復制出大量與母(mu)鏈模板中所(suo)需的(de)(de)DNA片段(duan)互(hu)補的(de)(de)子鏈DNA的(de)(de)過程。

　　PCR的(de)大特(te)(te)點是其擴(kuo)增(zeng)產物(wu)的(de)特(te)(te)異(yi)(yi)性(xing)、擴(kuo)增(zeng)效率(lv)的(de)靈(ling)敏性(xing)、擴(kuo)增(zeng)程序的(de)簡便(bian)性(xing)。引物(wu)序列(lie)及其與模板結合的(de)特(te)(te)異(yi)(yi)性(xing)是決定PCR反應結果的(de)關鍵。PCR技術(shu)是一(yi)種DNA體外合成放大技術(shu)，具有擴(kuo)增(zeng)效率(lv)高(gao)，擴(kuo)增(zeng)特(te)(te)異(yi)(yi)性(xing)高(gao)，擴(kuo)增(zeng)體系和技術(shu)簡便(bian)成熟的(de)特(te)(te)點，是當今(jin)生物(wu)學相關實(shi)驗室廣泛(fan)使用的(de)一(yi)項(xiang)技術(shu)。

　　二、PCR技術服務的循環步驟

　　PCR反應(ying)過程實(shi)際上是一(yi)(yi)個(ge)(ge)溫度循環變化(hua)的過程，一(yi)(yi)般包括變性---退火---延伸三個(ge)(ge)基本反應(ying)步驟，其基本步驟如下：

　　(1)模板DNA的(de)變(bian)性：模板DNA經加(jia)熱至(zhi)92～96℃以(yi)上保(bao)溫(wen)1～3分(fen)鐘，使模板DNA雙鏈(lian)或(huo)經PCR擴增形成的(de)雙鏈(lian)DNA解(jie)離(li)，使之成為單鏈(lian)，以(yi)便它與引物結合，為下輪反(fan)(fan)應(ying)作準備;雖然變(bian)性時(shi)間決(jue)定于多種因(yin)素(su)模板DNA的(de)復雜性、反(fan)(fan)應(ying)管的(de)幾何學、PCR儀的(de)種類甚至(zhi)反(fan)(fan)應(ying)體積，但是實際經驗(yan)中(zhong)，94℃保(bao)溫(wen)3分(fen)鐘即可(ke)以(yi)滿足絕大(da)部分(fen)反(fan)(fan)應(ying)的(de)需求。另(ling)外，對(dui)于GC含(han)量(liang)較高的(de)DNA模板，加(jia)入甘油、延長時(shi)間、應(ying)用核(he)酸類似(si)物可(ke)以(yi)提高PCR產(chan)物的(de)產(chan)量(liang)。

　　(2)模(mo)板(ban)DNA與(yu)引(yin)(yin)物的(de)(de)退火(復性)：模(mo)板(ban)DNA經加(jia)熱變性成單鏈后，37～65℃保溫0.5～1分鐘，寡核(he)苷(gan)酸引(yin)(yin)物與(yu)模(mo)板(ban)DNA單鏈的(de)(de)互(hu)補序(xu)列配對結(jie)合(he);這一步的(de)(de)溫度(du)取決于引(yin)(yin)物與(yu)靶序(xu)列的(de)(de)同源性程(cheng)度(du)和寡核(he)苷(gan)酸引(yin)(yin)物的(de)(de)堿基組成。引(yin)(yin)物的(de)(de)摩爾(er)數(shu)由于大(da)于靶序(xu)列，因(yin)此它們與(yu)互(hu)補序(xu)列的(de)(de)配對速度(du)在反應中比模(mo)板(ban)雙(shuang)鏈之間(jian)的(de)(de)重(zhong)新(xin)配對要快幾個數(shu)量級(ji)。

　　(3)引物(wu)的(de)延伸：DNA模(mo)板(ban)(ban)---引物(wu)結合物(wu)體(ti)系在(zai)(zai)68～72℃延伸保(bao)溫(wen)相應時(shi)間(此步驟(zou)具體(ti)溫(wen)度(du)視熱(re)穩(wen)定DNA聚(ju)合酶(mei)(mei)的(de)種(zhong)類而(er)定，而(er)保(bao)溫(wen)時(shi)間則在(zai)(zai)考(kao)慮DNA聚(ju)合酶(mei)(mei)效率的(de)基(ji)礎上，依(yi)據反(fan)應產(chan)物(wu)的(de)長度(du)決定，如目(mu)前常(chang)用的(de)DNA聚(ju)合酶(mei)(mei)Taq酶(mei)(mei)在(zai)(zai)72℃下每分鐘約可以擴(kuo)增(zeng)長度(du)為(wei)(wei)(wei)(wei)1Kb左右(you)的(de)DNA片段，因此要(yao)擴(kuo)增(zeng)兩2Kb的(de)DNA片段時(shi)本步驟(zou)的(de)保(bao)溫(wen)溫(wen)度(du)應設(she)置為(wei)(wei)(wei)(wei)72℃、時(shi)間為(wei)(wei)(wei)(wei)2分鐘)，在(zai)(zai)DNA聚(ju)合酶(mei)(mei)的(de)作用下，以dNTP為(wei)(wei)(wei)(wei)反(fan)應原(yuan)料，靶序(xu)列(lie)為(wei)(wei)(wei)(wei)模(mo)板(ban)(ban)，按堿基(ji)配對與(yu)半保(bao)留(liu)復(fu)制(zhi)原(yuan)理，合成一條新的(de)與(yu)模(mo)板(ban)(ban)DNA 鏈(lian)互補(bu)的(de)半保(bao)留(liu)復(fu)制(zhi)鏈(lian)。

　　重復循環(huan)變性---退火---延伸三過程，就可(ke)獲得更多的(de)(de)“半保留復制(zhi)鏈(lian)”，而且這種新鏈(lian)又可(ke)成為下次循環(huan)的(de)(de)模(mo)板(ban)使得每個循環(huan)中新擴增(zeng)的(de)(de)目的(de)(de)片段數量以指數式(shi)增(zeng)長。經(jing)過一(yi)定(ding)數量的(de)(de)循環(huan)之后，待(dai)擴目的(de)(de)DNA片段的(de)(de)數量將(jiang)被(bei)擴增(zeng)放大幾百萬(wan)倍。到達平(ping)臺期(qi)所需循環(huan)次數取決于(yu)樣品中模(mo)板(ban)的(de)(de)拷貝。